摘要结合疫苗的载体蛋白不仅承担多糖抗原的连接作用还参与T细胞相关免疫应答因此载体选择需要同时考虑蛋白质结构、偶联位点、分子均一性、抗原表位及既往免疫背景。CRM197和白喉类毒素均与天然白喉毒素具有相近的结构和免疫学关系但前者通过G52E单点突变丧失催化活性后者主要依赖甲醛化学脱毒二者在赖氨酸修饰、偶联条件及质量控制方面存在差异。本文从结合疫苗载体选型的实际问题出发解析CRM197为什么常被用于多糖结合疫苗研究39个赖氨酸残基意味着什么以及抗载体抗体与载体诱导的表位抑制CIES应该怎样理解。关键词结合疫苗载体蛋白、CRM197、CRM197蛋白、多糖偶联、白喉类毒素、载体蛋白选型、39个赖氨酸、G52E、抗载体抗体、CIES、结合疫苗、免疫原性一、结合疫苗为什么需要把多糖与载体蛋白连接起来部分细菌荚膜多糖属于胸腺非依赖性抗原特别是TI-2型抗原。这类多糖能够被免疫系统识别但对于婴幼儿等特定人群其诱导高亲和力抗体及持久免疫记忆的能力可能受到限制。因此结合疫苗采用的一个重要技术思路是将多糖抗原与合适的蛋白质载体连接使原本主要通过非T细胞依赖途径发挥作用的多糖抗原能够获得T细胞相关免疫帮助从而改善IgG应答和记忆B细胞形成。在这个过程中载体蛋白并不是单纯为了提供一个方便连接的化学支架。载体自身的免疫学特征、蛋白质结构、抗原表位以及与多糖连接后的状态都可能参与决定最终疫苗制剂的性质。因此评价一种载体是否合适不能只看“能不能偶联”还要看偶联后蛋白质是否保持合理的结构和抗原加工特征以及最终多糖抗原能否产生预期的免疫应答。CRM197和白喉类毒素正是经常被放在同一研究框架中比较的两类白喉毒素相关蛋白。两者具有相近的结构来源却采用完全不同的毒性消除路线因此在化学工艺和免疫学评价中需要分别理解。二、CRM197与白喉类毒素的第一项区别脱毒方式完全不同白喉类毒素属于化学脱毒蛋白经典方法通过甲醛处理等方式使天然白喉毒素丧失毒性同时尽量保留其抗原性。其化学基础涉及蛋白质侧链修饰和交联因此脱毒以后得到的材料不一定由完全相同的分子形式组成。不同蛋白质分子可能发生不同程度的修饰这使其在分子均一性和反应位点方面具有需要特别关注的特征。CRM197则属于基因突变形式的无毒白喉毒素相关蛋白主要通过催化域中的一个明确氨基酸替换使天然毒素酶活性丧失因此不需要为了获得该无毒突变体而采用同样的甲醛脱毒步骤。其优势并不意味着蛋白质不再需要质量控制而是研究人员能够围绕明确的氨基酸序列及相对一致的分子结构开展后续表征。因此对于多糖偶联载体选型而言白喉类毒素和CRM197的区别可以概括为前者通过蛋白质化学修饰实现脱毒后者通过序列层面的单点突变实现催化活性丧失。两种路线都会影响后续工艺开发但涉及的关键质量变量并不相同。三、为什么理解天然白喉毒素结构有助于解释CRM197的应用特点白喉毒素Diphtheria ToxinDT来源于携带tox基因相关噬菌体的白喉棒状杆菌。成熟蛋白由535个氨基酸组成分子量约58 kDa初始为单链蛋白经相应蛋白酶处理以后可形成通过二硫键连接的A、B片段。从结构功能角度看该蛋白包含催化域、跨膜域和受体结合域三个主要区域因此可以分别完成细胞受体识别、胞内转位和酶催化相关作用。图1天然白喉毒素的蛋白质结构示意图结构域残基范围功能催化域C 区1~187 位ADP-核糖基转移酶活性中心跨膜域T 区201~384 位介导内体膜转位受体结合域R 区387~535 位识别细胞表面受体表1白喉毒素的三个功能域天然白喉毒素能够通过受体结合区域识别细胞表面的HB-EGF相关受体经过内吞和内体膜转位以后使催化片段进入细胞质。该催化片段能够利用NAD⁺进行ADP-核糖基转移对真核翻译延伸因子eEF2上的白喉酰胺Diphthamide位点进行修饰。eEF2功能受到影响以后细胞正常蛋白质合成过程被抑制这就是天然白喉毒素具有较强细胞毒性的主要分子基础。图2白喉酰胺Diphthamide结构示意图从载体蛋白研究角度看这套机制说明天然白喉毒素的毒性集中涉及明确的催化作用。因此如果通过适当的分子变化使这一催化过程失效而蛋白质其他结构特征得以保留就可能形成具有白喉相关抗原性但缺乏天然毒素催化活性的蛋白材料。四、CRM197的G52E突变为什么是关键结构特征CRM197属于交叉反应物质Cross-reacting MaterialCRM相关蛋白中的一种。相关历史研究还包括CRM30和CRM45等其他突变体但CRM197的突出特点是其与天然白喉毒素之间只有一个明确的氨基酸差异即第52位甘氨酸替换为谷氨酸G52E对应tox基因中的一个G→A碱基变化。这一变化虽然发生在蛋白质序列中的单个位点却能够影响其原本的ADP-核糖基转移酶功能。Malito等人2012年发表的结构研究显示CRM197与天然白喉毒素在整体折叠方面高度相似但与NAD结合口袋相关的活性位点环发生改变从而影响正常NAD⁺结合及酶催化活性。图3CRM197蛋白结构示意图这也解释了为什么CRM197与传统化学脱毒类毒素之间的比较不应该只集中在是否具有细胞毒性。CRM197在大部分蛋白质结构与免疫相关区域方面保留了天然白喉毒素的特征而催化功能通过明确的点突变发生变化。因此它能够作为结构相对确定的蛋白质材料被进一步用于结合疫苗载体及相关免疫学研究。五、CRM197有39个赖氨酸这是否意味着具有39个完全相同的偶联位点在多糖结合疫苗中蛋白质与多糖的连接可能涉及赖氨酸侧链上的氨基因此载体蛋白的赖氨酸数量、修饰状态和反应可及性会直接影响偶联工艺设计。原稿提到CRM197具有39个赖氨酸残基由于该蛋白不需要经过甲醛化学脱毒这些赖氨酸不会因为脱毒过程而被预先消耗。白喉类毒素的情况则不同。甲醛能够与蛋白质中的部分氨基发生反应赖氨酸也是相关化学修饰可能涉及的重要残基之一。当部分赖氨酸已经参与甲醛相关修饰或交联时后续如果使用相同官能团进行多糖偶联可用位点便可能受到影响。因此在采用赖氨酸相关偶联化学的工艺中CRM197保留原始赖氨酸残基的特点具有实际研究价值。但需要注意39个赖氨酸表示蛋白质序列中具有39个相应残基并不意味着这39个位点在实际三维结构中全部暴露、具有相同活性或者能够同时达到相同偶联效率。载体选择时真正应该关注的是所采用的偶联方法是否适合目标蛋白最终偶联产物能否维持合理的结构与抗原性以及批次间能否实现一致质量而不是仅凭赖氨酸数量评价载体优劣。六、分子均一性为什么会影响结合疫苗工艺开发结合疫苗制造涉及载体蛋白、目标多糖和相应偶联工艺最终产物本身可能具有一定分子量分布与偶联异质性。如果载体蛋白原料在进入偶联工艺之前已经包含多种不同程度的化学修饰形式那么后续产品的分析和工艺一致性控制就可能更加复杂。白喉类毒素属于非定点化学脱毒材料其分子异质性与甲醛相关修饰和交联有关具体程度取决于制备条件和质量标准。原稿列出了60%~70%的相关纯度数据但这类数值不能作为所有类毒素材料通用的质量结论应结合具体来源和分析方法判断。CRM197通过G52E突变丧失催化活性其蛋白质序列具有更加明确的分子基础。这一特点有利于围绕蛋白质完整性、分子结构和偶联后产物进行分析也能够减少由脱毒步骤本身引入的部分化学异质性。不过结构明确并不等于任何生产来源的CRM197都具有相同纯度或相同质量。不同生产体系、纯化工艺以及产品级别仍然需要独立进行质量控制。因此CRM197的优势主要体现在明确的分子结构基础而不是完全不需要后续原料和工艺验证。七、白喉类毒素和CRM197的载体特点怎样比较从结合疫苗研发角度原稿按照可用偶联位点、T细胞表位完整性、分子均一性、脱毒试剂残留、抗载体抗体水平及典型用途对白喉类毒素与CRM197进行了比较。选型维度白喉类毒素CRM197可用偶联位点赖氨酸被甲醛修饰消耗数量减少完整保留可用于偶联T 细胞表位完整性交联修饰可能掩盖部分表位无化学修饰表位更完整分子均一性异质性较高混合物结构单一确定脱毒试剂残留需控制游离甲醛含量无抗载体抗体水平相对较高相对较低典型应用场景白喉疫苗抗原DTaP、Td 等结合疫苗载体蛋白表2白喉类毒素与CRM197作为结合疫苗载体的对比表中的结构、偶联和残留项目能够反映两类脱毒路线的一般技术区别但抗载体抗体水平属于高度依赖研究体系的免疫学指标。即使某些文献观察到CRM197相关载体免疫应答低于白喉类毒素也不能据此推断所有疫苗、所有接种人群或所有免疫程序都会得到同样结果。八、抗载体抗体越低是不是意味着CRM197免疫原性越弱在结合疫苗中载体蛋白需要发挥免疫学功能因此不能把较低的抗载体抗体水平简单理解为没有免疫原性。CRM197虽然失去了白喉毒素的正常催化活性但仍然保留大量能够参与免疫识别的蛋白质结构和抗原表位所以具备明确的免疫原性。原稿同时提到白喉类毒素作为游离蛋白在部分比较条件下可能显示不同于CRM197的免疫原性而经过甲醛处理后的蛋白质结构和抗原加工方式也可能参与形成这种差异。这说明载体蛋白的免疫学表现不仅与其是否存在酶活性有关还与蛋白质修饰及制剂条件相关。在实际研发中载体免疫应答需要与多糖抗原相关应答一起评价。如果某一载体能够诱导明显免疫反应但没有帮助目标多糖形成理想免疫应答就不能简单认为该载体已经满足研究目标。相反不能因为某次实验检测到的抗载体抗体水平相对较低就判断载体不具备足够免疫学功能。九、CIES是什么为什么可能影响不同载体蛋白的表现载体诱导的表位抑制Carrier-Induced Epitopic SuppressionCIES涉及既往针对载体蛋白的免疫状态可能影响后续糖结合抗原应答的现象。由于含白喉类毒素的疫苗已经长期应用相关人群可能具有针对白喉抗原的预存免疫背景因此不同载体和不同免疫程序下的后续应答可能存在差异。原稿引用的Pecetta等人研究比较了CRM197和白喉类毒素作为载体时预先接触载体对相应糖结合物免疫原性的影响。该研究说明即使两种蛋白来源相近具体免疫背景也可能改变最终结果。但CIES并不是一个可以简单概括为“CRM197一定更好”的结论。载体相关免疫反应与抗原类型、免疫剂量、既往接种情况和其他制剂因素密切相关目前不同研究对于其临床意义仍然存在讨论。因此载体选型应将CIES视为需要考虑和验证的免疫学变量而不是单独决定选择哪一种蛋白质的唯一依据。十、为什么不建议在已有结合疫苗工艺中直接替换载体当一个结合疫苗工艺已经使用白喉类毒素时不能因为CRM197具有更明确的点突变结构就认为直接替换以后能够获得完全一致的偶联结果。两类蛋白质在赖氨酸修饰状态、蛋白质异质性、表位暴露和其他分子特征方面存在差异因此相同的偶联条件可能形成不同性质的结合物。同样如果现有研究体系使用CRM197也不能简单认为换成白喉类毒素只是改了一个材料名称。即使两种载体均能够参与多糖偶联最终偶联产物的分子特征、免疫原性及质量标准仍然需要重新评价。从工艺开发角度看载体替换涉及的是整体产品设计的变化而不只是蛋白质原料变更。因此必须重新考虑偶联条件、相关质量属性、免疫学表现及后续研究资料而不能只比较分子量或蛋白质外观。十一、CRM197载体蛋白研究还应该关注什么对于开展结合疫苗载体蛋白研究的团队CRM197的选型重点可以概括为蛋白质身份、结构完整性、关键催化活性状态、偶联位点及其可及性、抗原相关表征和批间质量一致性。由于不同科研级蛋白材料与临床疫苗生产所需原材料之间可能存在不同质量要求研究人员还需要明确所使用材料的具体用途。例如研究级CRM197能够用于蛋白质结构、多糖偶联方法以及免疫学基础研究但这并不自动意味着同一材料能够不经额外质量评价直接用于人体疫苗制造。相关CRM197载体蛋白技术资料可以用于了解该类研究材料的技术背景具体适用范围仍需以对应产品及研究要求为准。因此载体选型的核心不应停留在“CRM197更均一”或者“白喉类毒素更加传统”这样的简单判断而应该结合目标多糖、偶联反应和最终研究终点建立完整的技术评价逻辑。十二、总结为什么CRM197成为重要的结合疫苗载体研究对象CRM197在结合疫苗领域受到关注主要源于其明确的G52E突变、缺乏天然白喉毒素的正常催化活性、相对完整的蛋白质结构以及无需经过甲醛化学脱毒这一分子特征。对于采用赖氨酸等蛋白质侧链进行多糖偶联的工艺这些特点有利于分析反应位点和蛋白质分子均一性。但真正的结合疫苗载体选型仍然需要同时评价抗原表位、载体免疫应答、既往免疫背景、偶联后产物质量和实际研究结果。CRM197与白喉类毒素并不是可以无条件互换的两种材料关于抗载体抗体和CIES的研究结果也需要放在具体实验体系中理解。因此对CRM197的正确认识不应该是“一个完全没有免疫原性的白喉脱毒蛋白”而应该是“通过单点突变丧失天然毒素催化活性、仍保留相关抗原性并具有明确结构基础的结合疫苗载体蛋白”。参考文献[1] Uchida T, Pappenheimer AM Jr, Greany R. Diphtheria toxin and related proteins. I. Isolation and properties of mutant proteins serologically related to diphtheria toxin. J Biol Chem. 1973;248(11):3838-3844.[2] Giannini G, Rappuoli R, Ratti G. The amino-acid sequence of two non-toxic mutants of diphtheria toxin: CRM45 and CRM197. Nucleic Acids Res. 1984;12(10):4063-4069.[3] Malito E, Bursulaya B, Chen C, et al. Structural basis for lack of toxicity of the diphtheria toxin mutant CRM197. Proc Natl Acad Sci USA. 2012;109(14):5229-5234.[4] Bröker M, Costantino P, DeTora L, et al. Biochemical and biological characteristics of cross-reacting material 197 (CRM197), a non-toxic mutant of diphtheria toxin. Biologicals. 2011;39(4):195-204.[5] Pecetta S, Lo Surdo P, Tontini M, et al. Carrier priming with CRM197 or diphtheria toxoid has a different impact on the immunogenicity of the respective glycoconjugates. Vaccine. 2015;33(2):314-320.[6] Choe S, Bennett MJ, Fujii G, et al. The crystal structure of diphtheria toxin. Nature. 1992;357(6375):216-220.关于技术来源本文基于CRM197、白喉毒素及白喉类毒素相关公开学术文献曼博生物MineBio整理发布用于科研信息分享、蛋白质载体研究及结合疫苗工艺开发思路参考。文中关于39个赖氨酸、G52E突变、甲醛脱毒、抗载体抗体和CIES的内容均应结合具体文献及实验条件理解不应将任何单一实验结论直接推广到全部结合疫苗配方。涉及具体CRM197研究材料时应注意科研用途与临床疫苗生产质量要求之间的区别。